来源：农业农村部
农业农村部将加强对鸡传染性支气管炎活疫苗等4种兽用疫苗产品监督抽检力度，对发现的非法添加或改变制苗用毒种行为，按照兽药严重违法行为从重处罚情形严厉查处。
附件：
1.鸡传染性支气管炎活疫苗中非法添加/改变制苗用毒种检测方法
2.鸡传染性法氏囊病活疫苗中非法添加/改变制苗用毒种检测方法
3.鸡新城疫活疫苗中非法添加/改变制苗用毒种检测方法
4.禽用灭活疫苗中非法添加禽腺病毒Ⅰ群全病毒抗原检测方法
2023年10月23日
1.适用范围
1.1本方法适用于鸡传染性支气管炎活疫苗中非法添加/改变制苗用毒种的检测。
1.2非法添加/改变制苗用毒种的检测范围为GI-1谱系(Mass-like)、GI-13谱系(4/91-like)、GI-19谱系(QX-like)和GI-
22谱系(LDT3-A-like)的鸡传染性支气管炎病毒核酸。
2.试验材料
2.1引物
针对鸡传染性支气管炎病毒(Infectious Bronchitis Virus,IBV)不同毒株基因序列差异区,分别设计针对IBV的一对通用型引物和检测GI-1谱系(Mass-like)、GI-13谱系(4/91-like)、GI-19谱系(QX-like)和GI-22谱系(LDT3A-like)的4对特异性引物，详见表1。
表1检测IBV的通用型引物和不同谱系毒株的特异性引物
2.2阳性对照和阴性对照
阳性对照:
GI-1谱系(Mass-like)代表毒株为鸡传染性支气管炎病毒(H120株),毒种编号为CVCC AV1514;
GI-13谱系(4/91-like)代表毒株为鸡传染性支气管炎病毒(IBV/CK/49101株),毒种编号为CVCC AV1567;
GI-19谱系(QX-like)代表毒株为鸡传染性支气管炎病毒(IBV/CK/QX01株),毒种编号为CVCC AV1568;
GI-22谱系(LDT3A-like)代表毒株为鸡传染性支气管炎病毒(IBV/CK/ldt3a01株),毒种编号为CVCC AV1569。
以上代表毒株均来源于国家兽医微生物菌(毒)种保藏中心。
阴性对照:生理盐水或无菌水。
2.3试剂
RNA提取试剂盒、RT-PCR试剂、琼脂糖、50xTAE、DNA marker、无核酸酶水、生理盐水。
3.检测方法
3.1样品稀释
取疫苗按瓶签标示，用生理盐水稀释至每毫升至少含250羽份；阳性对照按瓶签标示原倍或10倍稀释后使用。
3.2RNA提取
将稀释后的疫苗和阴、阳性对照按商品化核酸提取试剂盒进行RNA核酸提取。
3.3RT-PCR反应
将3.2步骤提取的RNA进行反转录操作,按商品化的一步法RT-PCR试剂盒说明书进行RT-PCR反应。RT-PCR反应程序如下：第一阶段,反转录50℃30min；第二阶段,预变性92℃2min;第三阶段,PCR扩增94℃30s，55℃30s,72℃1min,共30个循环，最后72℃延伸5min。RT-PCR反应体系见表2:
表2 RT-PCR反应体系(50μL)
3.4电泳
配制1%琼脂糖凝胶,取10μL RT-PCR产物进行电泳，120V，30min。
4.结果判定
4.1试验成立条件:阴性对照应无条带,各谱系代表毒株应扩增出相应大小条带,分别为:
鸡传染性支气管炎病毒通用引物应扩增出大小约为266bp的条带;
GI-1谱系(Mass-like)代表毒株鸡传染性支气管炎病毒(H120株)应扩增出大小约为360bp的条带;
GI-13谱系(4/91-like)代表毒株鸡传染性支气管炎病毒(IBV/CK/49101株)应扩增出大小约为328bp的条带;
GI-19谱系(QX-like)代表毒株鸡传染性支气管炎病毒(IBV/CK/QX01株)应扩增出大小约为340bp的条带;
GI-22谱系(LDT3A-like)代表毒株鸡传染性支气管炎病毒(IBV/CK/ldt3a01株)应扩增出大小约为787bp的条带。
4.2检测样品如不出现大小约为266bp的条带，则判定样品中不含IBV核酸;检测样品如出现大小约为360bp的条带，则判定样品中检出GI-1谱系(Mass-like)的IBV核酸;如出现大小约为328bp的条带，则判定样品中检出GI-13谱系(4/91-like)的IBV核酸;如出现大小约为340bp的条带，则判定样品中检出GI-19谱系(QX-like)的IBV核酸；如出现大小约为787bp的条带，则判定样品中检出GI-22谱系(LDT3A-like)的IBV核酸。
附件2：鸡传染性法氏囊病活疫苗中非法添加/改变制苗用毒种检测方法
1.适用范围
1.1本方法适用于鸡传染性法氏囊病活疫苗中非法添加/改变制苗用毒种的检测。
1.2非法添加/改变制苗用毒种的检测范围为鸡传染性法氏囊病病毒超强毒株、中等毒力及中等偏强毒力毒株、弱毒力毒株、变异株的鸡传染性法氏囊病病毒核酸。
2.试验材料
2.1引物
针对鸡传染性法氏囊病病毒(Infectious Bursal Disease Virus,IBDV)不同毒力毒株基因序列差异区,参考WOAH《陆生动物诊断试验与疫苗手册》第3.3.12鸡传染性法氏囊病,设计VP2高变区的一对通用引物。
Upper U3:5’-GCATGCGGTATGTGAGGCTTGGTGAC-3’,
Lower L3:5’-GAATTCGATCCTGTTGCCACTCTTTC-3’
2.2阳性对照
鸡传染性法氏囊病病毒阳性对照分别为：超强毒株代表毒株鸡传染性法氏囊病病毒(SD1205E5株)，毒种编号为CVCC AV358，来源于国家兽医微生物菌(毒)种保藏中心；
中等毒力及中等偏强毒力代表毒株鸡传染性法氏囊病病毒(CF株),毒种编号为CVCC AV164，来源于国家兽医微生物菌(毒)种保藏中心；
鸡传染性法氏囊病病毒(NF8株)，来源于乾元浩生物股份有限公司南京生物药厂;弱毒力毒株代表毒株鸡传染性法氏囊病病毒(B87株)，毒种编号为CVCC AV140,来源于国家兽医微生物菌(毒)种保藏中心；
变异株代表毒株鸡传染性法氏囊病病毒(LN2023株)，毒种编号为CVCC AV1570,来源于国家兽医微生物菌(毒)种保藏中心。
2.3试剂
RNA提取试剂盒、RT-PCR试剂、DNA片段回收试剂盒、限制性内切酶EagI-HF和StuI、琼脂糖、50xTAE、DNA marker、无核酸酶水、生理盐水。
3.检测方法
3.1样品稀释
取疫苗按瓶签标示,用生理盐水稀释至每毫升至少含10羽份。
阳性对照病毒含量至少应为100ELD50/0.1ml。
阴性对照:生理盐水或无菌水。
3.2RNA提取
将稀释后的疫苗和阴、阳性对照按商品化核酸提取试剂盒进行RNA核酸提取。
3.3RT-PCR反应
将3.2步骤提取的RNA进行反转录操作。RT-PCR反应程序如下：第一阶段，反转录，用六聚体随机引物作为反转录引物获得cDNA，在0.2ml PCR管中加入:RNA 8μL，random hexamers(50μg/μL)1μL，10mM dNTP mix 1μL，沸水浴5min，冰浴2min；再加入10μL cDNA合成预混液，反应体系见表1。
表1 cDNA合成预混液成分(10μL)
反转录反应条件:25℃10min；50℃50min；85℃5min。
第二阶段，95℃3min；95℃40s,60℃30s，72℃40s，30个循环；72℃延伸10min。反应体系见表2:
表2 PCR反应体系(50μL)
3.4PCR产物回收、酶切利用片段回收试剂盒对PCR产物进行回收,最终用32μL无核酸酶水进行洗脱。将回收产物利用EagI-HF和StuI进行酶切，酶切体系(50μL)：10x Cutsmart Buffer 5μL，DNA 30μL，EagI-HF1μL，StuI 1μL，ddH2O 13μL，混匀后37℃水浴4h。
3.5电泳
配置2%琼脂糖凝胶,取10μl酶切产物进行电泳，130V,40min。
4.结果判定
4.1试验成立条件,阴性对照应无条带,不同毒力代表毒株应出现相应大小条带,分别为:
超强毒株代表毒株鸡传染性法氏囊病病毒(SD1205E5株)、中等毒力及中等偏强毒力代表毒株鸡传染性法氏囊病病毒(CF株)应出现大小约为234bp、233bp和89bp条带,实际检测中仅可见234bp左右的一个条带，原因为233bp条带和234bp条带差异过小,会出现重叠。89bp条带片段过小，电泳不可见。
弱毒力代表毒株鸡传染性法氏囊病病毒(B87株)应出现大小约为556bp条带。
变异株代表毒株鸡传染性法氏囊病病毒(LN2023株)和中等毒力及中等偏强毒力代表毒株鸡传染性法氏囊病病毒(NF8株)应出现大小约为322bp和234bp条带。
4.2检测样品如出现大小约为556bp的条带，则判定样品中检出B87株类似IBDV核酸；如出现大小约为234bp的条带，则判定样品中检出CF株类似或者SD1205E5株类似IBDV核酸；如出现大小约为322bp和234bp的条带，则判定样品中检出LN2023株类似株或者NF8株类似IBDV核酸。
4.3如需明确具体的鸡传染性法氏囊病病毒种类,可将酶切片段回收后进行测序和blast比对。
附件3：鸡新城疫活疫苗中非法添加/改变制苗用毒种检测方法
1.适用范围
1.1本方法适用于鸡新城疫活疫苗中非法添加/改变制苗用毒种的检测。
1.2非法添加/改变制苗用毒种的检测范围为基因Ⅶ型新城疫病毒核酸。
1.3检测对象为鸡新城疫活疫苗La Sota株、Clone30株、F株、HB1株、N79株、CS2株、V4/HB92株、ZM10株、VG/GA株等疫苗株。
2.试验材料
2.1引物
针对鸡新城疫病毒(Newcastle Disease Virus,NDV)F基因保守区域设计一对通用型引物。
NDV-F(Universas型)-F:5’-ACAGGRTCAATCATAGT-3’
NDV-F(Universas型)-R:5’-CAGTAWGAGGTGTCAAG-3’
针对基因Ⅶ型新城疫病毒F基因差异序列，设计一对基因Ⅶ型特异性引物。
NDV-F(Ⅶ型)-F:5’-AGTTTAATAATACGGCGCGA-3’
NDV-F(Ⅶ型)-R:5’-GCAATAACTGAGCCYYTAAG-3’
2.2阳性对照和阴性对照
阳性对照:
鸡新城疫病毒La Sota株，毒种编号为CVCC AV1615，来源于国家兽医微生物菌(毒)种保藏中心。
基因Ⅶ型新城疫病毒核酸标准品，编号为CVCC Z333，来源于国家兽医微生物菌(毒)种保藏中心。
阴性对照:生理盐水或无菌水。
2.3试剂
RNA提取试剂盒、RT-PCR试剂、琼脂糖、50xTAE、DNA
marker、无核酸酶水、生理盐水。
3.检测方法
3.1样品稀释
取疫苗按瓶签标示,用生理盐水稀释至每毫升至少含100羽份；;阳性对照按瓶签标示原倍或10倍稀释后使用。
3.2RNA提取
将稀释后的疫苗和阴、阳性对照按商品化核酸提取试剂盒进行RNA核酸提取。
3.3RT-PCR反应
将3.2步骤提取的RNA进行一步法RT-PCR反应，一步法RT-PCR反应程序如下:50°C 30min,92°C 2min、94°C 30s、55°C 30s、72°C 1min,共30个循环,最后72°C延伸10min。一步法RT-PCR反应体系见表1:
表1一步法RT-PCR反应体系(25μL)
3.4电泳
配置1%琼脂糖凝胶,取10μl RT-PCR产物进行电泳，120V，30min。
4.结果判定
4.1试验成立条件,新城疫病毒(La Sota株)通用型引物应扩增出大小约为842bp条带，基因Ⅶ型新城疫病毒特异性引物应无条带；基因Ⅶ型新城疫病毒核酸标准品通用型引物应扩增出大小约为842bp条带，基因Ⅶ型新城疫病毒特异性引物应扩增出大小约为609bp特异性条带；阴性对照均无条带，则试验成立。
4.2样品用新城疫病毒通用型引物应扩增出大小约为842bp条带。若用基因Ⅶ型新城疫病毒特异性引物扩增出大小约为609bp条带，则判定样品中检出基因Ⅶ型新城疫病毒核酸。
附件4
禽用灭活疫苗中非法添加禽腺病毒Ⅰ群全病毒抗原检测方法
1.适用范围
1.1本方法适用于禽用灭活疫苗中非法添加制苗用毒种的检测。
1.2非法添加制苗用毒种的检测范围为禽腺病毒Ⅰ群全病毒抗原。
2.试验材料
2.1实验动物
SPF鸡，4~6周龄。
2.2试剂
禽腺病毒Ⅰ群琼脂扩散试验抗原，阴性对照为SPF鸡血清，阳性对照为禽腺病毒Ⅰ群琼脂扩散试验阳性血清，均来源于中国兽医药品监察所；琼脂粉或琼脂糖、氯化钠、PBS(0.01M、pH7.2)。
3.检测方法
3.1免疫
用4~6周龄SPF鸡15只,其中10只鸡按制品推荐的免疫途径和剂量进行免疫。首次免疫后14天，按照相同途径(不同部位)和剂量进行第二次免疫。另取5只作为不免疫对照组。第二次免疫后21日每只鸡分别采血，分离血清，用禽腺病毒I群琼脂扩散试验抗原进行抗体效价测定。
3.2抗体效价测定
3.2.1琼脂板制备
称取优质琼脂粉或琼脂糖1g、氯化钠8g,加入PBS(0.01M、pH7.2)溶液100ml中，置沸水中水浴加热融化，室温冷却至60~65℃后，倒入无菌平皿内(琼脂厚度约为5mm)，冷凝后加盖倒置平皿，防止水分蒸发，隔日使用应在2~8℃保存。
3.2.2打孔
用六角形打孔器在琼脂上打孔，孔径3~4mm，孔间间距3mm。
3.2.3封底
挑出孔中琼脂后,将平皿底部至酒精灯上微微加热，使孔底琼脂稍微融化封底。
3.2.4加样
中央孔滴加琼扩抗原50μl，第2、4孔滴加阳性对照各50μl，第6孔滴加阴性对照50μl,第1、3、5孔滴加待检血清，每孔50μl。
3.2.5反应将琼脂板放入湿盒中，置37℃温箱内2小时后倒置琼脂板，继续作用至24小时，然后移至室温再放置48~72小时，观察沉淀线。
3.2.6琼脂扩散试验(AGP)抗体检测结果判定
3.2.6.1试验成立条件，抗原孔与阳性对照之间出现沉淀线，与阴性对照之间无沉淀线出现，抗体检测试验成立。
3.2.6.2当待检血清与抗原孔之间形成沉淀线，并与阳性对照的沉淀线末端吻合，则待检血清判为阳性；当待检血清与抗原孔之间未形成沉淀线，但阳性对照的沉淀线末端向待检血清孔内侧偏弯,则判为弱阳性。弱阳性样品应重检一次，仍为弱阳性时可判为阳性；当待检血清与抗原孔之间未形成沉淀线，或阳性对照与抗原孔间的沉淀线末端向毗邻的待检血清孔直伸或向外侧偏弯时，则判该待检血清为阴性。
4.结果判定
4.1试验成立条件,对照组鸡AGP抗体应全部为阴性,试验成立。
4.2若待检样品免疫鸡血清1份及以上出现AGP抗体阳性，则判定该疫苗中添加了禽腺病毒Ⅰ群全病毒抗原；若待检样品免疫鸡血清均未出现AGP抗体阳性，则判定该疫苗中未添加禽腺病毒Ⅰ群全病毒抗原。
